New bio-products and technologies for valorization of Hypericum species (HypericumBiotech)

Este projecto incidirá sobre três espécies de Hypericum (H. perforatum H. androsaemum e H. undulatum). As espécies serão estabelecidas e mantidas em viveiro para garantir a matéria prima necessária à investigação aqui proposta. Estão previstos estudos de micropropagação visando apoiar potenciais produtores e visando a avaliação da produção in vitro de compostos activos. Serão também estabelecidas e optimizadas culturas in vitro de órgãos, calli e células em suspensão. Os estudos de caracterização química abrangem três diferentes tipos de extracto: óleos essenciais; extractos fenólicos; extractos lipídicos, de plantas in vivo e culturas in vitro das três espécies de Hypericum. Amostras dos três tipos de extracto serão analisadas por GC e GCMS (óleos essenciais e extractos lipídicos) e por HPLC (extractos fenólicos). Amostras dos três extractos distintos, isolados ou combinados, obtidos de plantas in vivo de Hypericum e alguns dos seus contituintes, serão submetidas a ensaios de actividade anti-microbiana, actividade anti-insecto, actividade nematotóxica e nematodicida, actividade antigenotóxica, e actividade antitumoral.
As actividades antimicrobianas terão como alvo leveduras, incluindo leveduras patogénicas, designadamente estirpes de Candida sp., e leveduras de contaminação alimentar bem como bactérias gram positivas e gram negativas. Os testes serão efectuados, inicialmente, com culturas em meio sólido, e posteriormente, em culturas em meio liquido para a determinação dos valores das concentrações mínimas inibitórias (MIC). Os mesmos testes serão ainda efectuados com componentes puros dos óleos essencial e dos extactos para identificação dos seus componentes activos. Será igualmente avaliada a actividade pro-apoptótica dos bioproductos que mostrarem maior actividade antifúngica.
As actividades anti-insecto serão conduzidas em laboratório sobre a lagarta das pastagens, Pseudaletia unipuncta Haworth (Lepidoptera: Noctuidae) e Ephestia Kuheniella (Lepidoptera: Pyralidae). Para os testes de actividades anti-alimentar e inibição do crescimento, as larvas serão alimentadas com a dieta artificial do insecto, tratada com os extractos da planta, avaliando-se o consumo alimentar, o peso larvar e a mortalidade. Com os dados obtidos, calcular-se-ão os índices de inibição alimentar, a taxa de crescimento larvar e outros índices nutricionais. Paralelamente avaliar-se-ão as actividades larvicida e ovicida de acordo com a metodologia descrita por Laurent et al. (1997): impregnação de um disco de papel com o extracto e por fumigação. Finalmente, avaliar-se-ão o efeito da exposição (por fumigação) dos adultos ao extracto vegetal sobre a oviposição.
As actividades nematotóxicas e/ou nematodicidas serão determinadas tendo como alvos nemátodes parasitas de plantas, designadamente Meloidogyne spp. Em todas as fases dos seus ciclos de vida. Os efeitos dos diferentes tipos de bio-produtos de Hypericum sp. serão determinados em diferentes condições e concentrações por monitorização da mobilidade e taxa de sobrevivência dos diferentes nemátodes. Na medida do possível, os estudos serão aprofundados no sentido de esclarecer o modo de acção dos referidos bioprodutos sobre os nemátodes.
As actividades antigenotóxicas de bio-produtos de Hypericum sp. serão avaliadas a diferentes níveis: danificação de DNA; morte celular por apoptose e proliferaçãocelular. Serão utilizadas células HepG2 e células Caco-2 tratadas por t-BHP, droga esta conhecida pelos danos que provoca no DNA. A este nível, a actividade antigenotóxica, a verificar-se, contrariará o efeito de t-BHP. Fluoro-marcadores e Kits de detecção baseados em anticorpos monoclonais serão utilizados na determinação da proliferação celular de células HepG2 e células Caco-2 expostas a bio-produtos de Hypericum sp. Os efeitos de tais bio-produtos de Hypericum sp. nos ciclos destas linhas celulares serão determinados com recurso a técnicas de citometria de fluxo. O efeitos do mesmo tipo de compostos de Hypericum sp na morte por apoptose, das linhas celulares-alvo (HepG2 e células Caco-2) serão determinados com recurso à técnica de TUNEL (Roche Molecular Biochemicals).
A actividade antitumoral será determinada em células HeLa e MKN45 tendo como controlo linhas não tumorais de células Vero, com recurso a métodos e técnicas em curso nos últimos dois anos no Laboratório CIRN da Universidade dos Açores. A viabilidade celular será determinada utilizando uma versão modificada do método colorimétrico de Mosmann (1983).